◎ Mikroswitches til alsidig, pålidelig on-demand væskehåndtering

Tak fordi du besøgte www.chinacdoe.com.Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse.For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer).I mellemtiden, for at sikre fortsat support, vil vi gengive webstedet uden stilarter og JavaScript.

Lab-on-a-chip-systemer med egenskaber på stedet giver mulighed for hurtig og præcis diagnose og er nyttige i ressourcebegrænsede omgivelser, hvor biomedicinsk udstyr og uddannede fagfolk ikke er tilgængelige.Det er dog stadig en stor udfordring at skabe et point-of-care-testsystem, der samtidig har alle de nødvendige funktioner til multifunktionel dispensering, on-demand-frigivelse, pålidelig ydeevne og langtidsopbevaring af reagenser.Her beskriver vi en håndtagsaktiveret mikro-rejsekontaktteknologi, der kan manipulere væsker i enhver retning, give præcis og proportional respons på påført lufttryk og forblive stabil mod pludselige bevægelser og vibrationer.Baseret på teknologien beskriver vi også udviklingen af ​​et polymerasekædereaktionssystem, der integrerer reagensintroduktion, blanding og reaktionsfunktioner i én proces, som opnår "prøve-i-svar-ud" ydeevne for alle kliniske næseprøver fra 18 patienter med Influenza og 18 individuelle kontroller, i god overensstemmelse med fluorescensintensiteten med standard polymerasekædereaktion (Pearson-koefficienter > 0,9).Baseret på teknologien beskriver vi også udviklingen af ​​et polymerasekædereaktionssystem, der integrerer reagensintroduktion, blanding og reaktionsfunktioner i én proces, som opnår "prøve-i-svar-ud" ydeevne for alle kliniske næseprøver fra 18 patienter med influenza og 18 individuelle kontroller, i god overensstemmelse med fluorescensintensiteten med standard polymerasekædereaktion (Pearson-koefficienter > 0,9).Основывabet ии Ввance ненин реагентов, сешиваниåbe и и линич egen (og 18 отдельных контролей, в хорошем соответствии интенсивности флуоресценции со стандартной полимек фициенты Пирсона> 0,9).Baseret på denne teknologi beskriver vi også udviklingen af ​​et polymerasekædereaktionssystem, der kombinerer funktionerne ved at injicere, blande og reagere i en enkelt proces, hvilket muliggør prøve-i-respons-ud for alle kliniske næseprøver fra 18 influenzapatienter.og 18 individuelle kontroller, i god overensstemmelse med standardpolymerasekædereaktionens fluorescensintensitet (Pearsons koefficienter > 0,9).Baseret på denne teknologi beskriver vi også udviklingen af ​​et polymerasekædereaktionssystem, der integrerer reagensinjektions-, blandings- og reaktionsfunktioner for at analysere alle kliniske næseprøver fra 18 nasale patientprøver i prøven. Influenza og 18 individuelle kontroller, fluorescensintensitet matchet godt med standard polymerasekædereaktion (Pearsons koefficient > 0,9).Den foreslåede platform garanterer pålidelig automatisering af biomedicinsk analyse og kan således fremskynde kommercialiseringen af ​​en række point-of-care testenheder.
Nye menneskelige sygdomme, såsom 2020 COVID-19-pandemien, der har kostet millioner af mennesker livet, udgør en alvorlig trussel mod global sundhed og menneskelig civilisation1.Tidlig, hurtig og præcis påvisning af sygdomme er afgørende for at kontrollere spredningen af ​​virussen og forbedre behandlingsresultaterne.Et kernediagnostisk økosystem baseret på centraliserede laboratorier, hvor testprøver sendes til hospitaler eller diagnostiske klinikker og drives af fagfolk, begrænser i øjeblikket adgangen for næsten 5,8 milliarder mennesker verden over, især dem, der lever i ressourcebegrænsede omgivelser.hvor der mangler dyrt biomedicinsk udstyr og kvalificerede specialister.klinikere 2. Der er således et presserende behov for at udvikle et billigt og brugervenligt lab-on-a-chip system med point-of-care testing (POCT), som kan give klinikere rettidig diagnostisk information til at træffe informerede diagnosebeslutninger .og behandling 3.
Verdenssundhedsorganisationens (WHO) retningslinjer angiver, at en ideel POCT skal være overkommelig, brugervenlig (let at bruge med minimal træning), nøjagtig (undgå falske negative eller falske positive), hurtig og pålidelig (give gode gentagelsesegenskaber) og leverbar (i stand til langtidslagring og let tilgængelig for slutbrugere)4.For at opfylde disse krav skal POCT-systemer give følgende egenskaber: alsidig dosering for at reducere manuel indgriben, on-demand frigivelse til skala reagenstransport for nøjagtige testresultater og pålidelig ydeevne til at modstå miljøvibrationer.I øjeblikket er den mest udbredte POCT-enhed den laterale flowstrimmel5,6 bestående af flere lag af porøse nitrocellulosemembraner, der skubber en meget lille mængde prøve fremad og reagerer med præ-immobiliserede reagenser ved kapillærkraft.Selvom de har fordelen ved lave omkostninger, brugervenlighed og hurtige resultater, kan flow-strip-baserede POCT-enheder kun bruges til biologiske tests (f.eks. glukosetest7,8 og graviditetstest9,10) uden at kræve flertrinsanalyser.reaktioner (f.eks. påfyldning af flere reagenser, blanding, multipleksing).Derudover giver de drivkræfter, der styrer væskebevægelser (dvs. kapillarkræfter), ikke god konsistens, især mellem batches, hvilket resulterer i dårlig reproducerbarhed11 og gør laterale flowbånd primært nyttige til god detektion12,13.
Udvidede produktionskapaciteter på mikro- og nanoskala har skabt muligheder for udvikling af mikrofluidiske POCT-enheder til kvantitative målinger14,15,16,17.Ved at justere egenskaberne af grænsefladen 18, 19 og geometrien af ​​kanalerne 20, 21, 22 kan kapillarkraften og strømningshastigheden af ​​disse anordninger styres.Deres pålidelighed, især for meget våde væsker, forbliver dog uacceptabel på grund af unøjagtigheder i fremstillingen, materialefejl og følsomhed over for miljøvibrationer.Da der desuden skabes en kapillarstrøm ved væske-gas-grænsefladen, kan der ikke indføres yderligere strøm, især efter fyldning af mikrofluidkanalen med væske.For mere kompleks påvisning skal der derfor udføres flere trin af prøveinjektion24,25.
Blandt mikrofluidiske enheder er centrifugale mikrofluidiske enheder i øjeblikket en af ​​de bedste løsninger til POCT26,27.Dens drivmekanisme er fordelagtig ved, at drivkraften kan styres ved at justere omdrejningshastigheden.Ulempen er imidlertid, at centrifugalkraften altid er rettet mod den ydre kant af enheden, hvilket gør det vanskeligt at implementere de flertrinsreaktioner, der kræves til mere komplekse analyser.Selvom yderligere drivkræfter (f.eks. kapillærer 28, 29 og mange andre 30, 31, 32, 33, 34, 35) ud over centrifugalkraften indføres til multifunktionel dosering, kan uforudset væskeoverførsel stadig forekomme, fordi disse yderligere kræfter generelt er ordrer af størrelsesorden lavere end centrifugalkraften, hvilket gør dem kun effektive over små driftsområder eller ikke tilgængelige efter behov med væskefrigivelse.Inkorporering af pneumatiske manipulationer i centrifugal mikrofluidik, såsom centrifugal kinetiske metoder 36, 37, 38, termopneumatiske metoder 39 og aktive pneumatiske metoder 40 har vist sig at være et attraktivt alternativ.Med den kontrafugodynamiske tilgang er et ekstra hulrum og forbindende mikrokanaler integreret i enheden til både ekstern og intern handling, selvom dens pumpeeffektivitet (i området fra 75% til 90%) er meget afhængig af antallet af pumpecyklusser og viskositeten af væsken.I den termopneumatiske metode er latexmembranen og væskeoverførselskammeret specifikt designet til at forsegle eller genåbne indløbet, når det indespærrede luftvolumen opvarmes eller afkøles.Imidlertid introducerer opvarmnings-/afkølingsopsætningen problemer med langsom respons og begrænser dens anvendelse i termofølsomme assays (f.eks. polymerasekædereaktion (PCR) amplifikation).Med en aktiv pneumatisk tilgang opnås on-demand udløsning og indadgående bevægelse gennem samtidig påføring af positivt tryk og præcist afstemte rotationshastigheder af højhastighedsmotorer.Der er andre vellykkede tilgange, der kun bruger pneumatiske aktuatorer (positivt tryk 41, 42 eller undertryk 43) og normalt lukkede ventildesign.Ved successivt at påføre tryk i det pneumatiske kammer pumpes væsken peristaltisk fremad, og den normalt lukkede ventil forhindrer tilbagestrømning af væske på grund af peristaltikken og realiserer dermed komplekse væskeoperationer.Men der er i øjeblikket kun et begrænset antal mikrofluidteknologier, der kan udføre komplekse væskeoperationer i en enkelt POCT-enhed, herunder multifunktionel dispensering, on-demand-frigivelse, pålidelig ydeevne, langtidsopbevaring, håndtering af højviskose væsker, og omkostningseffektiv fremstilling.Alt sammen på samme tid.Manglen på en flertrins funktionel operation kan også være en af ​​grundene til, at kun få kommercielle POCT-produkter som Cepheid, Binx, Visby, Cobas Liat og Rhonda er blevet introduceret på det åbne marked til dato.
I dette papir foreslår vi en pneumatisk mikrofluidisk aktuator baseret på Green Ring Micro Switch-teknologi (FAST).FAST kombinerer alle de nødvendige egenskaber på samme tid til en lang række reagenser fra mikroliter til milliliter.FAST består af elastiske membraner, håndtag og blokke.Uden påføring af lufttryk kan membraner, håndtag og blokke lukkes tæt, og væsken indeni kan opbevares i lang tid.Når passende tryk påføres og justeres til længden af ​​håndtaget, udvider membranen sig og skubber håndtaget til åben position, så væsken kan passere igennem.Dette muliggør multifunktionel måling af væsker i en kaskade, samtidig, sekventiel eller selektiv måde.
Vi har udviklet et PCR-system, der bruger FAST til at generere respons-i-prøve-resultater til påvisning af influenza A- og B-virus (IAV og IBV).Vi opnåede en nedre detektionsgrænse (LOD) på 102 kopier/ml, vores multiplex-assay viste specificitet for IAV og IBV og tillod influenzavirus-patotypning.De kliniske testresultater med næsepodningsprøven fra 18 patienter og 18 raske individer viser god overensstemmelse i fluorescensintensitet med standard RT-PCR (Pearson-koefficienter > 0,9).De kliniske testresultater med næsepodningsprøven fra 18 patienter og 18 raske individer viser god overensstemmelse i fluorescensintensitet med standard RT-PCR (Pearson-koefficienter > 0,9).Результаты клинических испытаний с использованием образца мазка из носа от 18 пациентов и 18 пациентов и 18 пациентов оответствие интенсивности флуоресценции стандартной ОТ-ПЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9).Resultaterne af kliniske forsøg med en næsepodningsprøve fra 18 patienter og 18 raske personer viser god overensstemmelse mellem fluorescensintensiteten af ​​standard RT-PCR (Pearsons koefficienter > 0,9).0,9）。。... Результаты клинических испытаний с использованием образцов назальных мазков от 18 пациентов и 18 пациентов и 18 ползованих тветствие между интенсивностью флуоресценции и стандартной ОТ-ПЦР (коэффициент Пирсона > 0,9).Resultaterne af kliniske forsøg med næsepodningsprøver fra 18 patienter og 18 raske individer viste god overensstemmelse mellem fluorescensintensitet og standard RT-PCR (Pearsons koefficient > 0,9).De anslåede materialeomkostninger for en FAST-POCT-enhed er ca. USD 1 (Supplerende tabel 1) og kan reduceres yderligere ved at bruge storskala fremstillingsmetoder (f.eks. sprøjtestøbning).Faktisk har FAST-baserede POCT-enheder alle de nødvendige funktioner påbudt af WHO og er kompatible med nye biokemiske testmetoder såsom termisk plasmacykling44, amplifikationsfri immunoassays45 og nanobody-funktionaliseringstest46, der er rygraden i POCT-systemer.mulighed.
På fig.1a viser strukturen af ​​FAST-POCT platformen, som består af fire væskekamre: et foropbevaringskammer, et blandekammer, et reaktionskammer og et affaldskammer.Nøglen til væskestrømskontrol er det HURTIGE design (bestående af elastiske membraner, håndtag og blokke) placeret i foropbevaringskammeret og blandekammeret.Som en pneumatisk aktiveret metode giver FAST-designet præcis væskestrømskontrol, herunder lukket/åben omskiftning, alsidig dosering, on-demand væskefrigivelse, pålidelig drift (f.eks. ufølsomhed over for miljøvibrationer) og langtidsopbevaring.FAST-POCT platformen består af fire lag: et bagsidelag, et elastisk filmlag, et plastfilmlag og et dæklag, som vist i forstørret billede i fig. 1b (også vist i detaljer i supplerende figurer S1 og S2) ).Alle kanaler og væsketransportkamre (såsom foropbevaring og reaktionskamre) er indlejret i PLA (polymælkesyre) substrater, der spænder fra 0,2 mm (tyndeste del) til 5 mm tykke.Det elastiske filmmateriale er en 300 µm tyk PDMS, der let udvider sig, når der påføres lufttryk på grund af dets "tynde tykkelse" og lave elasticitetsmodul (ca. 2,25 MPa47).Polyethylenfilmlaget er lavet af polyethylenterephthalat (PET) med en tykkelse på 100 µm for at beskytte den elastiske film mod overdreven deformation på grund af lufttryk.Svarende til kamrene har substratlaget håndtag forbundet til dæklaget (lavet af PLA) med hængsler for at styre væskestrømmen.Den elastiske film blev limet til bagsidelaget med dobbeltklæbende tape (ARseal 90880) og dækket med en plastfilm.Tre lag blev samlet på et substrat ved hjælp af et T-clip design i dæklaget.T-klemmen har et mellemrum mellem to ben.Da clipsen blev sat ind i rillen, bøjede de to ben let, vendte derefter tilbage til deres oprindelige tilstand og bandt låget og bagsiden tæt, da de passerede gennem rillen (Supplerende Fig. S1).De fire lag samles derefter ved hjælp af stik.
Skematisk diagram af platformen, der illustrerer de forskellige funktionelle rum og funktioner i FAST.b Forstørret diagram af FAST-POCT platformen.c Foto af platformen ved siden af ​​en amerikansk kvart dollarmønt.
FAST-POCT platformens arbejdsmekanisme er vist i figur 2. Nøglekomponenterne er klodserne på basislaget og hængslerne på dæklaget, hvilket resulterer i et interferensdesign, når de fire lag samles ved hjælp af en T-form .Når der ikke påføres lufttryk (fig. 2a), bevirker interferenspasningen, at hængslet bøjes og deformeres, og en tætningskraft påføres gennem håndtaget for at presse den elastiske film mod blokken, og væsken i tætningshulrummet defineres. som en forseglet tilstand.Det skal bemærkes, at i denne tilstand er håndtaget bøjet udad, som vist i sidebilledet i fig. 2a.Når der tilføres luft (fig. 2b), udvider den elastiske membran sig udad mod dækslet og skubber håndtaget op, hvorved der åbnes et mellemrum mellem håndtaget og blokken, så væske kan strømme ind i det næste kammer, hvilket er defineret som en åben tilstand .Efter udløsning af lufttrykket kan håndtaget vende tilbage til sin oprindelige position og forblive stramt på grund af hængslets elasticitet.Videoer af håndtagets bevægelser præsenteres i den supplerende film S1.
A. Skematisk diagram og fotografier, når de er lukket.I mangel af tryk presser håndtaget membranen mod blokken, og væsken forsegles.b I god stand.Når der påføres tryk, udvider membranen sig og skubber håndtaget op, så kanalen åbner og væske kan strømme.c Bestem den karakteristiske størrelse af det kritiske tryk.Karakteristiske dimensioner inkluderer længden af ​​håndtaget (L), afstanden mellem skyderen og hængslet (l) og tykkelsen af ​​håndtagets fremspring (t).Fs er komprimeringskraften ved gasspjældet B. q er den ensartet fordelte belastning på håndtaget.Tx* repræsenterer drejningsmomentet udviklet af det hængslede håndtag.Kritisk tryk er det tryk, der kræves for at hæve håndtaget og få væsken til at flyde.d Teoretiske og eksperimentelle resultater af sammenhængen mellem kritisk tryk og grundstofstørrelse.n = 6 uafhængige eksperimenter blev udført, og data er vist som ± standardafvigelse.Rådata præsenteres som rådatafiler.
En analytisk model baseret på stråleteorien er blevet udviklet til at analysere afhængigheden af ​​det kritiske tryk Pc, ved hvilken spalten åbner sig, af de geometriske parametre (for eksempel er L længden af ​​håndtaget, l er afstanden mellem blokken og hængsel, S er håndtaget. Kontaktområdet med væsken t er tykkelsen af ​​håndtagets fremspring, som vist i fig. 2c).Som beskrevet i de supplerende bemærkninger og den supplerende figur S3, åbner mellemrummet, når \({P}_{c}\ge \frac{2{F}_{s}l}{SL}\), hvor Fs er drejningsmomentet \ ({T}_{x}^{\ast}(={F}_{s}l)\) for at eliminere kræfterne forbundet med en interferenspasning og få hængslet til at bøje.Den eksperimentelle respons og den analytiske model viser god overensstemmelse (fig. 2d), hvilket viser, at det kritiske tryk Pc stiger med stigende t/l og faldende L, hvilket let kan forklares med den klassiske strålemodel, dvs. drejningsmomentet stiger med t /Lift .Vores teoretiske analyse viser således tydeligt, at det kritiske tryk effektivt kan styres ved at justere håndtagslængden L og t/l-forholdet, hvilket giver et vigtigt grundlag for designet af FAST-POCT platformen.
FAST-POCT-platformen giver multifunktionel dispensering (vist i figur 3a med indsættelse og eksperiment), som er den vigtigste egenskab ved vellykket POCT, hvor væsker kan strømme i enhver retning og i enhver rækkefølge (kaskade, samtidig, sekventiel) eller selektiv multikanal udlevering.– doseringsfunktion.På fig.3a(i) viser en kaskadedelt doseringstilstand, hvor to eller flere kamre er kaskadekoblet ved brug af blokke til at adskille de forskellige reaktanter og en håndtag til at styre den åbne og lukkede tilstand.Når der påføres tryk, strømmer væsken fra det øvre til det nedre kammer i en kaskade måde.Det skal bemærkes, at kaskadekamrene kan fyldes med våde kemikalier eller tørre kemikalier, såsom lyofiliseret pulver.I eksperimentet i fig. 3a(i) flyder den røde blæk fra det øvre kammer sammen med det blå farvepulver (kobbersulfat) ind i det andet kammer og bliver mørkeblåt, når det når det nedre kammer.Den viser også styretrykket for den væske, der pumpes.På samme måde, når et håndtag er forbundet med to kamre, bliver det den samtidige injektionstilstand, som vist i fig.3a(ii), hvor væsken kan fordeles ensartet over to eller flere kamre, når der påføres tryk.Da det kritiske tryk afhænger af håndtagets længde, kan længden af ​​håndtaget justeres for at opnå et sekventielt injektionsmønster som vist i fig.3a(iii).Et langt håndtag (med kritisk tryk Pc_lang) blev forbundet til kammer B og et kort håndtag (med kritisk tryk Pc_short > Pc_long) blev forbundet til kammer A. Da der blev påført tryk P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) blev kun væsken i rødt kan strømme til kammer B, og når trykket blev øget til P2 (> Pc_short), kan den blå væske strømme til kammer A. Denne sekventielle injektionstilstand gælder for forskellige væsker, der overføres til deres relaterede kamre i rækkefølge, hvilket er afgørende for en vellykket POCT enhed.Et langt håndtag (med kritisk tryk Pc_lang) blev forbundet til kammer B og et kort håndtag (med kritisk tryk Pc_short > Pc_long) blev forbundet til kammer A. Da der blev påført tryk P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) blev kun væsken i rødt kan strømme til kammer B, og når trykket blev øget til P2 (> Pc_short), kan den blå væske strømme til kammer A. Denne sekventielle injektionstilstand gælder for forskellige væsker, der overføres til deres relaterede kamre i rækkefølge, hvilket er afgørende for en vellykket POCT enhed.Длинный рычаг (с критическим давлением Pc_long) был соединен с камерой B, а короткий рычаг (с критическим Pc_long) инен с камерой A. При приложении давления P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) только жидкость, выделенная красным может камеру B, и когда давление было увеличено до P2 (> Pc_short), синяя жидкость может течь в камеру камеру Эжоледско а применяется к различным жидкостям, последовательно перемещаемым в соответствующие камеры, чето имеще шной POCT.Et langt håndtag (med kritisk tryk Pc_lang) blev forbundet til kammer B, og et kort håndtag (med kritisk tryk Pc_short > Pc_long) blev forbundet til kammer A. Når tryk P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) påføres, er kun væsken fremhævet i rød kan strømme ind i kammer B, og når trykket er blevet øget til P2 (> Pc_short), kan den blå væske strømme ind i kammer A. Denne sekventielle injektionstilstand anvendes på forskellige væsker sekventielt overført til de respektive kamre, hvilket er kritisk for vellykket POCT.enhed. Gennemgang рой A.Den lange arm (kritisk tryk Pc_lang) er forbundet til kammer B, og den korte arm (kritisk tryk Pc_short > Pc_long) er forbundet til kammer A.При приложении давления P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) в камеру B может поступать только красная жидкость, а пшливич (P_sh ort) в камеру A может поступать синяя жидкость.Når tryk P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) påføres, kan kun rød væske komme ind i kammer B, og når trykket øges til P2 (> Pc_short), kan blå væske komme ind i kammer A. Denne sekventielle injektionstilstand er velegnet til sekventiel overførsel af forskellige væsker ind i de respektive kamre, hvilket er afgørende for en vellykket drift af POCT-enheden.Figur 3a(iv) viser den selektive injektionstilstand, hvor hovedkammeret havde et kort (med kritisk tryk Pc_short) og et langt håndtag (med kritisk tryk Pc_long < Pc_short), der desuden var forbundet til henholdsvis kammer A og kammer B. til en anden luftkanal forbundet til kammer B. For at overføre væsken til kammer A først blev tryk P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) og P2 (P2 > P1) med P1 + P2 > Pc_short påført apparatet på samme tid.Figur 3a(iv) viser den selektive injektionstilstand, hvor hovedkammeret havde et kort (med kritisk tryk Pc_short) og et langt håndtag (med kritisk tryk Pc_long < Pc_short), der desuden var forbundet til henholdsvis kammer A og kammer B. til en anden luftkanal forbundet til kammer B. For at overføre væsken til kammer A først blev tryk P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) og P2 (P2 > P1) med P1 + P2 > Pc_short påført apparatet på samme tid.På fig.3а(iv) показан режим селективного впрыска, при котором основная камера имела короткий (с критическим давын.) (med критическим давлением Pc_long < Pc_short), которые дополнительно соединялись с камерой A og камерой B соответветствет.3a(iv) viser den selektive injektionstilstand, hvor hovedkammeret havde en kort (med kritisk tryk Pc_short) og en lang arm (med kritisk tryk Pc_long < Pc_short), som yderligere var forbundet med henholdsvis kammer A og kammer B.кдругому воздушному каналу, соединенному с камерой B. Чтобы сначала передать жидкость в камерон A, квур вали давление P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) og P2 (P2 > P1), где P1 + P2 > Pc_short.til en anden luftkanal forbundet til kammer B. For først at overføre væske til kammer A blev trykket P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) og P2 (P2 > P1) samtidigt påført indretningen, hvor P1 + P2 > Pc_short. 3а (iv) показан режим селектиåbe E ззном канал, подключенному к комнате B.3a(iv) viser den selektive injektionstilstand, når hovedkammeret har en kort spindel (kritisk tryk Pc_short) og en lang spindel (kritisk tryk Pc_long < Pc_short) forbundet til henholdsvis kammer A og kammer B, og ud over en anden luftpassage, forbundet til rum B.P2 forhindrer således væske i at komme ind i kammer B;i mellemtiden oversteg det totale tryk P1 + P2 det kritiske tryk for at aktivere det kortere håndtag forbundet til kammer A for at tillade væskestrømmen til kammer A. Derefter, når kammer B skulle fyldes, behøver vi kun at anvende P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) i hovedkammeret for at aktivere det lange håndtag og lade væsken strømme til kammer B. Det kan tydeligt observeres fra tiden t = 3 s til 9 s, at væsken i kammer A forblev konstant, mens den steg i kammeret B, når tryk P1 blev påført.i mellemtiden oversteg det totale tryk P1 + P2 det kritiske tryk for at aktivere det kortere håndtag forbundet til kammer A for at tillade væskestrømmen til kammer A. Derefter, når kammer B skulle fyldes, behøver vi kun at anvende P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) i hovedkammeret for at aktivere det lange håndtag og lade væsken strømme til kammer B. Det kan tydeligt observeres fra tiden t = 3 s til 9 s, at væsken i kammer A forblev konstant, mens den steg i kammeret B, når tryk P1 blev påført.М egen A, чтоыы позволaksis жидости теч в камеру A. затем, коose kort ) в основной камере, чтобы активировать длинный рычаг и дать жидкости течь в камеру B. Можно ясно , Можно ясно 3 til 9 med жидкость в камере En оставалась постоянной, в то время как в камере она увеличивалась.I mellemtiden har det totale tryk P1 + P2 overskredet det kritiske tryk for at aktivere en kortere håndtag forbundet til kammer A for at tillade væske at strømme ind i kammer A. Når kammer B skal fyldes, behøver vi kun at anvende P1 (Pc_long < P1) < Pc_short ) i hovedkammeret for at aktivere det lange håndtag og lade væsken strømme ind i kammer B. Det kan tydeligt observeres, at mellem t = 3 s og 9 s forblev væsken i kammer A konstant, mens den i kammer steg.B når tryk P1 påføres.Samtidig overstiger det samlede tryk P1 + P2 det kritiske tryk, hvilket aktiverer det kortere håndtag, der forbinder kammer A, hvilket tillader væske at strømme ind i kammer A.Når det er tid til at fylde kammer A, påfører vi blot P1 i hovedkammeret og P2 i det sekundære kammer.På denne måde kan flowadfærden skiftes selektivt mellem kamera A og B. Flowadfærden for de fire multifunktionelle distributionstilstande kan findes i den supplerende film S2.
a Illustration af multifunktionel tildeling, dvs. (i) kaskade, (ii) samtidig, (iii) sekventiel og (iv) selektiv tildeling.Kurverne repræsenterer arbejdsgangen og parametrene for disse fire distributionstilstande.b Resultater af langtidsopbevaringstest i deioniseret vand og ethanol.n = 5 uafhængige eksperimenter blev udført, og data er vist som ± sd c.Stabilitetstest demonstrationer, når FAST enheden og kapillarventilen (CV) enheden var i (i) statisk og (ii) vibrerende tilstand.(iii) Volumen vs. tid for FAST- og CV-enheder ved forskellige vinkelfrekvenser.d Offentliggørelse af testresultater efter behov for (i) FAST-enhed og (ii) CV-enhed.(iii) Forholdet mellem volumen og tid for FAST- og CV-enheder, der anvender intermitterende tryktilstand.Alle skala barer, 1 cm.Rådata leveres som rådatafiler.
Langtidsopbevaring af reagenser er en anden vigtig egenskab ved en vellykket POCT-enhed, der vil gøre det muligt for utrænet personale at håndtere flere reagenser.Mens mange teknologier har vist deres potentiale for langtidsopbevaring (f.eks. 35 mikrodispensere, 48 blisterpakninger og 49 stick-pakninger), kræves der et dedikeret modtagerum for at rumme pakken, hvilket øger omkostningerne og kompleksiteten;desuden tillader disse opbevaringsmekanismer ikke dispensering efter behov og resulterer i spild af reagenser på grund af rester i emballagen.Langtidslagringsevnen blev verificeret ved at udføre en accelereret levetidstest ved hjælp af CNC-bearbejdet PMMA-materiale på grund af dets lille ruhed og modstand mod gasgennemtrængning (Supplerende figur S5).Testapparatet blev fyldt med deioniseret vand (deioniseret vand) og 70% ethanol (simulerende flygtige reagenser) ved 65°C i 9 dage.Både deioniseret vand og ethanol blev opbevaret ved hjælp af aluminiumsfolie for at blokere adgangen fra oven.Arrhenius-ligningen og penetrationsaktiveringsenergien rapporteret i litteraturen50,51 blev brugt til at beregne realtidsækvivalenten.På fig.3b viser de gennemsnitlige vægttabsresultater for 5 prøver opbevaret ved 65°C i 9 dage, svarende til 0,30% for deioniseret vand og 0,72% for 70% ethanol over 2 år ved 23°C.
På fig.3c viser vibrationstesten.Da kapillarventilen (CV) er den mest populære væskehåndteringsmetode blandt eksisterende POCT28,29-enheder, blev en CV-enhed 300 µm bred og 200 µm dyb brugt til sammenligning.Det kan ses, at når begge enheder forbliver stationære, forsegler væsken i FAST-POCT platformen, og væsken i CV-enheden låser sig på grund af den pludselige udvidelse af kanalen, hvilket reducerer kapillærkræfterne.Men efterhånden som orbitalvibratorens vinkelfrekvens stiger, forbliver væsken i FAST-POCT-platformen forseglet, men væsken i CV-enheden strømmer ind i det nedre kammer (se også Supplerende film S3).Dette tyder på, at de deformerbare hængsler på FAST-POCT-platformen kan påføre modulet en stærk mekanisk kraft for tæt at lukke væsken i kammeret.Men i CV-enheder tilbageholdes væske på grund af balancen mellem de faste, luft- og væskefaser, hvilket skaber ustabilitet, og vibrationer kan forstyrre balancen og forårsage uventet strømningsadfærd.Fordelen ved FAST-POCT platformen er, at den giver pålidelig funktionalitet og undgår fejl ved tilstedeværelse af vibrationer, der normalt opstår under levering og drift.
En anden vigtig egenskab ved FAST-POCT-platformen er dens on-demand-udgivelse, som er et nøglekrav til kvantitativ analyse.På fig.3d sammenligner on-demand-udgivelsen af ​​FAST-POCT-platformen og CV-enheden.Fra fig.3d(iii) ser vi, at FAST-enheden reagerer hurtigt på tryksignalet.Når der blev påført tryk på FAST-POCT platformen, strømmede væsken, når trykket blev udløst, stoppede strømmen øjeblikkeligt (fig. 3d(i)).Denne handling kan forklares med den hurtige elastiske tilbageføring af hængslet, som presser håndtaget tilbage mod blokken og lukker kammeret.Væske fortsatte dog med at strømme i CV-enheden, hvilket til sidst resulterede i et uventet væskevolumen på ca. 100 µl, efter at trykket blev udløst (Figur 3d(ii) og Supplerende film S4).Dette kan forklares ved forsvinden af ​​den kapillære pinning-effekt ved fuldstændig befugtning af CV'et efter den første injektion.
Evnen til at håndtere væsker med varierende befugtningsevne og viskositet i den samme enhed er fortsat en udfordring for POCT-applikationer.Dårlig befugtning kan føre til utætheder eller anden uventet strømningsadfærd i kanalerne, og hjælpeudstyr såsom hvirvelblandere, centrifuger og filtre er ofte påkrævet for at fremstille højviskose væsker 52 .Vi testede forholdet mellem kritisk tryk og væskeegenskaber (med en bred vifte af fugtbarhed og viskositet).Resultaterne er vist i tabel 1 og video S5.Det ses, at væsker med forskellig befugtningsevne og viskositet kan forsegles i kammeret, og når der påføres tryk, kan selv væsker med en viskositet på op til 5500 cP overføres til det tilstødende kammer, hvilket gør det muligt at detektere prøver med høj viskositet (dvs. sputum, en meget tyktflydende prøve, der bruges til diagnosticering af luftvejssygdomme).
Ved at kombinere ovennævnte multifunktionelle dispenseringsenheder kan en bred vifte af FAST-baserede POCT-enheder udvikles.Et eksempel er vist i figur 1. Anlægget indeholder et foropbevaringskammer, et blandekammer, et reaktionskammer og et affaldskammer.Reagenser kan opbevares i præ-opbevaringskammeret i længere tid og derefter udledes i blandekammeret.Med det rigtige tryk kan de blandede reaktanter selektivt overføres til et affaldskammer eller et reaktionskammer.
Fordi PCR-detektion er guldstandarden for påvisning af patogener som H1N1 og COVID-19 og involverer flere reaktionstrin, brugte vi FAST-POCT-platformen til PCR-detektion som en applikation.På fig.4 viser PCR-testprocessen ved brug af FAST-POCT-platformen.Først blev elueringsreagenset, magnetisk mikroperlereagens, vaskeopløsning A og vaskeopløsning W pipetteret ind i henholdsvis præ-opbevaringskamrene E, M, W1 og W2.Stadierne af RNA-adsorption er vist i fig.4a og er som følger: (1) når tryk P1 (=0,26 bar) påføres, bevæger prøven sig ind i kammer M og udledes i blandekammeret.(2) Lufttryk P2 (= 0,12 bar) tilføres gennem port A forbundet til bunden af ​​blandekammeret.Selvom en række blandingsmetoder har vist deres potentiale i blanding af væsker på POCT-platforme (f.eks. serpentinblanding 53, tilfældig blanding 54 og batchblanding 55), er deres blandingseffektivitet og effektivitet stadig ikke tilfredsstillende.Den anvender bobleblandingsmetoden, hvor luft indføres i bunden af ​​blandekammeret for at skabe bobler i væsken, hvorefter den kraftige hvirvel kan opnå fuldstændig blanding inden for få sekunder.Bobleblandingsforsøg blev udført, og resultaterne er præsenteret i supplerende figur S6.Det kan ses, at når der påføres et tryk på 0,10 bar, tager fuldstændig blanding omkring 8 sekunder.Ved at øge trykket til 0,20 bar opnås fuldstændig blanding på ca. 2 sekunder.Metoder til beregning af blandingseffektivitet er præsenteret i afsnittet Metoder.(3) Brug en rubidiummagnet til at udtrække perlerne, tryk derefter P3 (= 0,17 bar) gennem port P for at flytte reagenserne ind i affaldskammeret.På fig.4b, c viser vasketrinene for at fjerne urenheder fra prøven som følger: (1) Vaskeopløsningen A fra kammeret W1 udtømmes i trykblandekammeret P1.(2) Udfør derefter bobleblandingsprocessen.(3) Vaskeopløsningen A overføres til affaldsvæskekammeret, og mikroperlerne i blandekammeret trækkes ud af magneten.Vask W (fig. 4c) svarede til vask A (fig. 4b).Det skal bemærkes, at hvert vasketrin A og W blev udført to gange.Figur 4d viser elueringstrinene til eluering af RNA'et fra perlerne;eluerings- og blandingsintroduktionstrinnene er de samme som RNA-adsorptions- og vasketrinene beskrevet ovenfor.Efterhånden som elueringsreagenserne overføres til PCR-reaktionskammeret under tryk P3 og P4 (=0,23 bar), nås det kritiske tryk for at forsegle armen af ​​PCR-reaktionskammeret.På samme måde hjælper P4-trykket også med at tætne passagen til affaldskammeret.Således blev alle elueringsreagenser jævnt fordelt mellem de fire PCR-reaktionskamre for at initiere multiplekse PCR-reaktioner.Ovenstående procedure er præsenteret i Supplementary Movie S6.
I RNA-adsorptionstrinnet indføres prøven i indløbet M og injiceres i blandekammeret sammen med den tidligere opbevarede perleopløsning.Efter blanding og fjernelse af granulatet fordeles reagenserne i affaldskammeret.b og c vasketrin, indfør forskellige forlagrede vaskereagenser i blandekammeret, og efter blanding og fjernelse af perlerne overføres reagenserne til spildvæskekammeret.d Elueringstrin: Efter indføring af elueringsreagenser, blanding og perleekstraktion overføres reagenserne til PCR-reaktionskammeret.Kurverne viser arbejdsgangen og relaterede parametre for de forskellige stadier.Tryk er det tryk, der udøves gennem de enkelte kamre.Volumen er volumenet af væske i blandekammeret.Alle skala barer er 1 cm.Rådata leveres som rådatafiler.
En PCR-testprocedure blev udført, og supplerende figur S7 viser termiske profiler, herunder 20 minutters omvendt transkriptionstid og 60 minutters termisk cyklingstid (95 og 60 °C), med en termisk cyklus på 90 s (Supplerende film S7)..FAST-POCT kræver mindre tid at gennemføre en termisk cyklus (90 sekunder) end konventionel RT-PCR (180 sekunder for en termisk cyklus).Dette kan forklares med det høje forhold mellem overfladeareal og volumen og den lave termiske inerti i mikro-PCR-reaktionskammeret.Kammeroverfladen er 96,6 mm2 og kammervolumen er 25 mm3, hvilket gør forholdet mellem overflade og volumen ca. 3,86.Som det ses i supplerende figur S10, har PCR-testområdet på vores platform en rille på bagpanelet, hvilket gør bunden af ​​PCR-kammeret 200 µm tykt.En termisk ledende elastisk pude er fastgjort til varmeoverfladen af ​​temperaturregulatoren, hvilket sikrer tæt kontakt med bagsiden af ​​testboksen.Dette reducerer platformens termiske inerti og forbedrer opvarmnings-/køleeffektiviteten.Under termisk cykling smelter paraffinen, der er indlejret i platformen, og flyder ind i PCR-reaktionskammeret og fungerer som et tætningsmiddel for at forhindre reagensfordampning og miljøforurening (se supplerende film S8).
Alle PCR-detektionsprocesser beskrevet ovenfor blev fuldt automatiseret ved hjælp af et specialfremstillet FAST-POCT-instrument, bestående af en programmeret trykkontrolenhed, en magnetisk ekstraktionsenhed, en temperaturkontrolenhed og en fluorescerende signalindfangnings- og behandlingsenhed.Det skal bemærkes, at vi brugte FAST-POCT-platformen til RNA-isolering og brugte derefter de ekstraherede RNA-prøver til PCR-reaktioner ved hjælp af FAST-POCT-systemet og desktop PCR-systemet til sammenligning.Resultaterne var næsten de samme som vist i Supplerende Figur S8.Operatøren udfører en simpel opgave: introducerer prøven i M-kammeret og indsætter platformen i instrumentet.Kvantitative testresultater er tilgængelige på cirka 82 minutter.Detaljeret information om FAST-POCT værktøjer kan findes i den supplerende figur.C9, C10 og C11.
Influenza forårsaget af influenza A (IAV), B (IBV), C (ICV) og D (IDV) virus er et almindeligt globalt fænomen.Af disse er IAV og IBV ansvarlige for de mest alvorlige tilfælde og sæsonbestemte epidemier, der inficerer 5-15% af verdens befolkning, forårsager 3-5 millioner alvorlige tilfælde og forårsager 290.000-650.000 dødsfald årligt.Luftvejssygdomme56,57.Tidlig diagnosticering af IAV og IB er afgørende for at reducere sygelighed og tilhørende økonomisk byrde.Blandt tilgængelige diagnostiske teknikker anses den reverse transkriptase-polymerasekædereaktion (RT-PCR) for at være den mest følsomme, specifikke og nøjagtige (>99%)58,59.Blandt tilgængelige diagnostiske teknikker anses den reverse transkriptase-polymerasekædereaktion (RT-PCR) for at være den mest følsomme, specifikke og nøjagtige (>99%)58,59.Среди доступных диагностических методов полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (Рессиптазой (Русский) тельной, специфичной и точной (> 99%)58,59.Blandt de tilgængelige diagnostiske metoder anses omvendt transkriptase-polymerasekædereaktion (RT-PCR) for at være den mest følsomme, specifikke og nøjagtige (> 99%)58,59. Из доступных диагностических методов полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТеППЦЦР) льной, специфичной и точной (>99%)58,59.Af de tilgængelige diagnostiske metoder anses revers transkriptase polymerase kædereaktion (RT-PCR) for at være den mest følsomme, specifikke og nøjagtige (>99%)58,59.Traditionelle RT-PCR-metoder kræver dog gentagen pipettering, blanding, dispensering og overførsel af væske, hvilket begrænser deres brug af fagfolk i ressourcebegrænsede omgivelser.Her blev FAST-POCT-platformen brugt til PCR-detektion af henholdsvis IAV og IBV for at opnå deres nedre detektionsgrænse (LOD).Derudover er IAV og IBV blevet multiplekset for at skelne mellem forskellige patotyper på tværs af arter, hvilket giver en lovende platform for genetisk analyse og evnen til nøjagtigt at behandle sygdommen.
På fig.5a viser resultaterne af HAV PCR-test under anvendelse af 150 µl oprenset viralt RNA som en prøve.På fig.5a(i) viser, at ved en HAV-koncentration på 106 kopier/ml kan fluorescensintensiteten (ΔRn) nå 0,830, og når koncentrationen reduceres til 102 kopier/ml, kan ΔRn stadig nå 0,365, hvilket svarer til højere end det. af den tomme negative kontrolgruppe (0,002), omkring 100 gange højere.Til kvantificering baseret på seks uafhængige eksperimenter blev en lineær kalibreringskurve genereret mellem log koncentration og cyklustærskel (Ct) af IAV (Fig. 5a(ii)), R2 = 0,993, varierende fra 102-106 kopier/ml.resultaterne er i god overensstemmelse med konventionelle RT-PCR-metoder.På fig.5a(iii) viser fluorescerende billeder af testresultater efter 40 cyklusser af FAST-POCT platformen.Vi fandt ud af, at FAST-POCT-platformen kan detektere HAV så lavt som 102 kopier/ml.Den traditionelle metode har dog ikke en Ct-værdi på 102 kopier/ml, hvilket gør den til en LOD på omkring 103 kopier/ml.Vi antog, at dette kan skyldes den høje effektivitet af bobleblanding.PCR-testeksperimenter blev udført på oprenset IAV RNA for at evaluere forskellige blandingsmetoder, herunder rysteblanding (samme blandingsmetode som ved konventionel RT-PCR-drift), hætteglasblanding (denne metode, 3 s ved 0,12 bar) og ingen blanding som kontrolgruppe ..Resultaterne kan findes i Supplerende Figur S12.Det kan ses, at ved en højere RNA-koncentration (106 kopier/mL) er Ct-værdierne for de forskellige blandingsmetoder næsten de samme som for bobleblanding.Da RNA-koncentrationen faldt til 102 kopier/mL, havde rysteblandingen og kontroller ingen Ct-værdier, mens bobleblandingsmetoden stadig gav en Ct-værdi på 36,9, hvilket var under Ct-tærsklen på 38. Resultaterne viser en dominerende blandingskarakteristik vesikler, hvilket også er påvist i anden litteratur, hvilket også kan forklare, hvorfor FAST-POCT platformens følsomhed er lidt højere end konventionel RT-PCR.På fig.5b viser resultaterne af PCR-analyse af oprensede IBV RNA-prøver i området fra 101 til 106 kopier/ml.Resultaterne svarede til IAV-testen og opnåede en R2 = 0,994 og en LOD på 102 kopier/ml.
en PCR-analyse af influenza A-virus (IAV) med IAV-koncentrationer i området fra 106 til 101 kopier/ml under anvendelse af TE-buffer som negativ kontrol (NC).(i) Realtidsfluorescenskurve.(ii) Lineær kalibreringskurve mellem logaritmisk IAV RNA-koncentration og cyklustærskel (Ct) for FAST og konventionelle testmetoder.(iii) IAV FAST-POCT fluorescerende billede efter 40 cyklusser.b, PCR-detektion af influenza B-virus (IBV) med (i) realtidsfluorescensspektrum.(ii) Lineær kalibreringskurve og (iii) FAST-POCT IBV fluorescensbillede efter 40 cyklusser.Den nedre detektionsgrænse (LOD) for IAV og IBV ved brug af FAST-POCT-platformen var 102 kopier/ml, hvilket er lavere end konventionelle metoder (103 kopier/ml).c Multiplex testresultater for IAV og IBV.GAPDH blev brugt som en positiv kontrol og TE buffer blev brugt som en negativ kontrol for at forhindre mulig kontaminering og baggrundsforstærkning.Der kan skelnes mellem fire forskellige prøvetyper: (1) GAPDH-only negative prøver ("IAV-/IBV-");(2) IAV-infektion ("IAV+/IBV-") med IAV og GAPDH;(3) IBV-infektion ("IAV-/IBV+") med IBV og GAPDH;(4) IAV/IBV-infektion ("IAV+/IBV+") med IAV, IBV og GAPDH.Den stiplede linje repræsenterer tærskellinjen.n = 6 biologisk uafhængige eksperimenter blev udført, data er vist som ± standardafvigelse.Rådata præsenteres som rådatafiler.
På fig.5c viser resultaterne af multipleksingstesten for IAV/IBV.Her blev viruslysat brugt som en prøveopløsning i stedet for oprenset RNA, og fire primere for IAV, IBV, GAPDH (positiv kontrol) og TE-buffer (negativ kontrol) blev tilsat til fire forskellige reaktionskamre på FAST-POCT-platformen.Positive og negative kontroller bruges her for at forhindre mulig kontaminering og baggrundsforøgelse.Testene blev opdelt i fire grupper: (1) GAPDH-negative prøver ("IAV-/IBV-");(2) IAV-inficeret ("IAV+/IBV-") versus IAV og GAPDH;(3) IBV-.inficeret ("IAV-") -/IBV+") IBV og GAPDH;(4) IAV/IBV ("IAV+/IBV+") infektion med IAV, IBV og GAPDH.På fig.5c viser, at når negative prøver blev påført, var fluorescensintensiteten ΔRn af det positive kontrolkammer 0,860, og ΔRn for IAV og IBV svarede til den negative kontrol (0,002).For IAV+/IBV-, IAV-/IBV+ og IAV+/IBV+ grupperne viste IAV/GAPDH, IBV/GAPDH og IAV/IBV/GAPDH kameraerne henholdsvis signifikant fluorescensintensitet, mens de andre kameraer endda viste fluorescensintensitet ved en baggrund niveau på 40 efter termisk cykling.Ud fra testene ovenfor viste FAST-POCT-platformen enestående specificitet og gjorde det muligt for os at patotype forskellige influenzavirus samtidigt.
For at validere den kliniske anvendelighed af FAST-POCT testede vi 36 kliniske prøver (næsepodningsprøver) fra IB-patienter (n=18) og ikke-IB-kontroller (n=18) (figur 6a).Patientoplysninger er vist i supplerende tabel 3. IB-infektionsstatus blev uafhængigt bekræftet, og undersøgelsesprotokollen blev godkendt af Zhejiang University First Affiliated Hospital (Hangzhou, Zhejiang).Hver prøve af patienter blev opdelt i to kategorier.Den ene blev behandlet ved hjælp af FAST-POCT, og den anden blev behandlet ved hjælp af et desktop PCR-system (SLAN-96P, Kina).Begge assays bruger de samme oprensnings- og detektionskit.På fig.6b viser resultaterne af FAST-POCT og konventionel revers transkriptions-PCR (RT-PCR).Vi sammenlignede fluorescensintensiteten (FAST-POCT) med -log2(Ct), hvor Ct er cyklustærsklen for konventionel RT-PCR.Der var god overensstemmelse mellem de to metoder.FAST-POCT og RT-PCR viste en stærk positiv korrelation med en Pearsons ratio (r) værdi på 0,90 (figur 6b).Vi vurderede derefter den diagnostiske nøjagtighed af FAST-POCT.Fluorescensintensitetsfordelinger (FL) for positive og negative prøver blev tilvejebragt som et uafhængigt analytisk mål (fig. 6c).FL-værdier var signifikant højere hos IB-patienter end hos kontroller (****P = 3,31 × 10-19; tosidet t-test) (fig. 6d).Dernæst blev kurver for IBV-modtagerdriftskarakteristika (ROC) plottet.Vi fandt, at den diagnostiske nøjagtighed var meget god, med et areal under kurven på 1 (fig. 6e).Bemærk venligst, at på grund af obligatorisk maskebestilling i Kina på grund af COVID-19 fra 2020, har vi ikke identificeret patienter med IBD, så alle positive kliniske prøver (dvs. næsepodningsprøver) var kun til IBV.
Design af klinisk undersøgelse.I alt 36 prøver, inklusive 18 patientprøver og 18 ikke-influenzakontroller, blev analyseret ved hjælp af FAST-POCT platformen og konventionel RT-PCR.b Vurder den analytiske overensstemmelse mellem FAST-POCT PCR og konventionel RT-PCR.Resultaterne var positivt korrelerede (Pearson r = 0,90).c Fluorescensintensitetsniveauer hos 18 IB-patienter og 18 kontroller.d Hos IB-patienter (+) var FL-værdier signifikant højere end i kontrolgruppen (-) (****P = 3,31 × 10-19; tosidet t-test; n = 36).For hvert kvadratisk plot repræsenterer den sorte markør i midten medianen, og boksens nederste og øverste linje repræsenterer henholdsvis 25. og 75. percentilen.Knurhårene strækker sig til minimums- og maksimumdatapunkterne, som ikke betragtes som afvigere.e ROC-kurve.Den stiplede linje d repræsenterer tærskelværdien estimeret fra ROC-analysen.AUC for IBV er 1. Rådata leveres som rådatafiler.
I denne artikel præsenterer vi FAST, som har de egenskaber, der kræves for en ideel POCT.Fordelene ved vores teknologi omfatter: (1) Alsidig dosering (kaskade, samtidig, sekventiel og selektiv), frigivelse efter behov (hurtig og proportional frigivelse af påført tryk) og pålidelig drift (vibration ved 150 grader) (2) langtidsopbevaring (2 års accelereret test, vægttab ca. 0,3%);(3) evnen til at arbejde med væsker med en bred vifte af befugtningsevne og viskositet (viskositet op til 5500 cP);(4) Økonomisk (estimerede materialeomkostninger for FAST-POCT PCR-enheden er ca. USD 1).Ved at kombinere multifunktionelle dispensere blev en integreret FAST-POCT platform til PCR-detektion af influenza A- og B-virus demonstreret og anvendt.FAST-POCT tager kun 82 minutter.De kliniske test med 36 næsepodningsprøver viste god overensstemmelse i fluorescensintensitet med standard RT-PCR (Pearson-koefficienter > 0,9).De kliniske test med 36 næsepodningsprøver viste god overensstemmelse i fluorescensintensitet med standard RT-PCR (Pearson-koefficienter > 0,9).(Kliniske tester с 36 образцами мазков из носа показали хорошее соответствие интенсивности флуданисц эффициенты Пирсона > 0,9).Kliniske test med 36 prøver af næsepodninger viste god overensstemmelse med fluorescensintensiteten af ​​standard RT-PCR (Pearsons koefficienter > 0,9). RT-PCR (Klinisk oversigt 36 образцов мазков из носа показали хорошее совпадение интенсивности флуоресанци эффициент Пирсона > 0,9).Klinisk testning af 36 næsepodningsprøver viste god overensstemmelse mellem fluorescensintensiteten med standard RT-PCR (Pearsons koefficient > 0,9).Parallelt med dette arbejde har forskellige nye biokemiske metoder (f.eks. plasma termisk cykling, amplifikationsfri immunoassays og nanobody-funktionaliseringsassays) vist deres potentiale i POCT.Men på grund af manglen på en fuldt integreret og robust POCT-platform kræver disse metoder uundgåeligt separate forbehandlingsprocedurer (f.eks. RNA-isolation44, incubation45 og washing46), hvilket yderligere supplerer det nuværende arbejde med disse metoder til implementering af avancerede POCT-funktioner med de nødvendige parametre.hent-i-svar-output ydeevne.I dette arbejde, selvom luftpumpen, der bruges til at aktivere FAST-ventilen, er lille nok til at blive integreret i et bordpladeinstrument (fig. S9, S10), forbruger den stadig betydelig strøm og genererer støj.I princippet kan mindre formfaktor pneumatiske pumper erstattes af andre midler, såsom brug af elektromagnetisk kraft eller fingeraktivering.Yderligere forbedringer kan f.eks. omfatte tilpasning af kits til forskellige og specifikke biokemiske assays ved brug af nye detektionsmetoder, der ikke kræver opvarmnings-/kølesystemer, hvilket giver en værktøjsfri POCT-platform til PCR-applikationer.Vi mener, at givet at FAST-platformen giver en måde at manipulere væsker på, mener vi, at den foreslåede FAST-teknologi præsenterer potentialet til at skabe en fælles platform ikke kun for biomedicinsk test, men også for miljøovervågning, fødevarekvalitetstestning, materiale- og lægemiddelsyntese ..
Indsamling og brug af humane næsepodningsprøver er blevet godkendt af den etiske komité på Zhejiang University First Affiliated Hospital (IIT20220330B).Der blev indsamlet 36 næsepodningsprøver, som involverede 16 voksne < 30 år, 7 voksne > 40 år og 19 mænd, 17 kvinder.Der blev indsamlet 36 næsepodningsprøver, som involverede 16 voksne < 30 år, 7 voksne > 40 år og 19 mænd, 17 kvinder.Было собрано 36 образцов мазков из носа, в которых приняли участие 16 взрослых < 30 лет, 7 меслет, 7 меслыш og 17 juni.Seksogtredive næsepodningsprøver blev indsamlet fra 16 voksne < 30 år, 7 voksne over 40 år, 19 mænd og 17 kvinder.Demografiske data er præsenteret i supplerende tabel 3. Informeret samtykke blev indhentet fra alle deltagere.Alle deltagere var mistænkt for at have influenza og blev testet frivilligt uden kompensation.
FAST base og låg er lavet af polymælkesyre (PLA) og printet af Ender 3 Pro 3D printer (Shenzhen Transcend 3D Technology Co., Ltd.).Dobbeltsidet tape blev købt fra Adhesives Research, Inc. Model 90880. PET-film 100 µm tyk blev købt fra McMaster-Carr.Både klæbemidlet og PET-filmen blev skåret ved hjælp af Silhouette Cameo 2-skæreren fra Silhouette America, Inc. Den elastiske film er lavet af PDMS-materiale ved sprøjtestøbning.Først blev en 200 µm tyk PET-ramme skåret ved hjælp af et lasersystem og limet til et 3 mm tykt PMMA-ark ved hjælp af 100 µm dobbeltsidet klæbende tape.PDMS-precursoren (Sylgard 184; Del A: Del B = 10:1, Dow Corning) blev derefter hældt i formen, og en glasstav blev brugt til at fjerne overskydende PDMS.Efter hærdning ved 70°C i 3 timer kunne den 300 μm tykke PDMS-film pilles af formen.
Billeder til alsidig distribution, on-demand publicering og pålidelig ydeevne tages med et højhastighedskamera (Sony AX700 1000 fps).Orbitalrysteren, der blev brugt i pålidelighedstesten, blev købt hos SCILOGEX (SCI-O180).Lufttrykket genereres af en luftkompressor, og flere digitale præcisionstrykregulatorer bruges til at justere trykværdien.Processen til test af flowadfærd er som følger.En forudbestemt mængde væske blev sprøjtet ind i testanordningen, og et højhastighedskamera blev brugt til at registrere strømningsadfærden.Stillbilleder blev derefter taget fra videoer af flowadfærden på faste tidspunkter, og det resterende areal blev beregnet ved hjælp af Image-Pro Plus-software, som derefter blev ganget med kameradybden for at beregne volumen.Detaljer om flowadfærdstestsystemet kan findes i Supplerende Figur S4.
Injicer 50 µl mikroperler og 100 µl deioniseret vand i hætteglassblandeanordningen.Blandede billeder blev taget med et højhastighedskamera hvert 0,1 sekund ved tryk på 0,1 bar, 0,15 bar og 0,2 bar.Pixelinformation under blandingsprocessen kan fås fra disse billeder ved hjælp af fotobehandlingssoftware (Photoshop CS6).Og blandingseffektivitet kan opnås med følgende ligning 53.
hvor M er blandingseffektiviteten, N er det samlede antal prøvepixel, og ci og \(\bar{c}\) er de normaliserede og forventede normaliserede koncentrationer.Blandingseffektiviteten går fra 0 (0 %, ublandet) til 1 (100 %, fuldt blandet).Resultaterne er vist i Supplerende Figur S6.
Real-time RT-PCR kit til IAV og IBV, inklusive IAV og IBV RNA prøver (kat. nr. RR-0051-02/RR-0052-02, Liferiver, Kina), Tris-EDTA buffer (TE buffer nr. B541019 , Sangon Biotech, Kina), positiv kontrol RNA-oprensningskit (delnr. Z-ME-0010, Liferiver, Kina) og GAPDH-opløsning (delnr. M591101, Sangon Biotech, Kina) er kommercielt tilgængelige.RNA-oprensningskittet inkluderer en bindingsbuffer, vaske A, vaske W, eluent, magnetiske mikroperler og en akrylbærer.IAV og IBV real-time RT-PCR kits inkluderer IFVA nukleinsyre PCR detektionsblanding og RT-PCR enzym.Tilsæt 6 µl AcrylCarrier og 20 µl magnetiske perler til 500 µl bindingsbufferopløsning, ryst godt og klargør derefter perleopløsningen.Tilsæt 21 ml ethanol til vask A og W, ryst godt for at opnå opløsninger af henholdsvis vask A og W.Derefter blev 18 µl fluorescerende PCR-blanding med IFVA-nukleinsyre og 1 µl RT-PCR-enzym tilsat til 1 µl TE-opløsning, rystet og centrifugeret i flere sekunder, hvilket gav 20 µl IAV- og IBV-primere.
Følg følgende RNA-oprensningsprocedure: (1) RNA-adsorption.Pipetter 526 µl af pelletopløsningen i et 1,5 ml centrifugerør og tilsæt 150 µl prøve, og ryst derefter røret manuelt op og ned 10 gange.Overfør 676 µl af blandingen til affinitetssøjlen og centrifuger ved 1,88 x 104 g i 60 sekunder.Efterfølgende dræn kasseres derefter.(2) Det første trin af vask.Tilsæt 500 µl af vaskeopløsning A til affinitetssøjlen, centrifuger ved 1,88 x 104 g i 40 s, og kassér den brugte opløsning.Denne vaskeproces blev gentaget to gange.(3) den anden fase af vask.Tilsæt 500 µl vaskeopløsning W til affinitetssøjlen, centrifuger ved 1,88 x 104 g i 15 s og kassér den brugte opløsning.Denne vaskeproces blev gentaget to gange.(4) Eluering.Tilsæt 200 µl eluat til affinitetssøjlen og centrifuger ved 1,88 x 104 g i 2 min.(5) RT-PCR: Eluatet blev injiceret i 20 μl af primeropløsningen i et PCR-rør, hvorefter røret blev placeret i et real-time PCR-testapparat (SLAN-96P) for at udføre RT-PCR-processen.Hele detektionsprocessen tager cirka 140 minutter (20 minutter til RNA-oprensning og 120 minutter til PCR-detektion).
526 µl perleopløsning, 1000 µl vaskeopløsning A, 1000 µl vaskeopløsning W, 200 µl eluat og 20 µl primeropløsning blev foreløbigt tilsat og opbevaret i kamrene M, W1, W2, E og PCR-detektionskammer.Platform montering.Derefter blev 150 µl af prøven pipetteret ind i kammer M, og FAST-POCT-platformen blev indsat i testinstrumentet vist i supplerende figur S9.Efter ca. 82 minutter var testresultaterne tilgængelige.
Medmindre andet er angivet, præsenteres alle testresultater som middelværdi ± SD efter minimum seks replikater ved brug af kun FAST-POCT-platformen og biologisk uafhængige prøver.Ingen data blev udelukket fra analysen.Forsøgene er ikke tilfældige.Forskerne var ikke blinde for gruppeopgaver under forsøget.
For mere information om undersøgelsesdesign, se Nature Research Report-abstraktet, der er knyttet til denne artikel.
Data, der understøtter resultaterne af denne undersøgelse, er tilgængelige i Supplerende information.Denne artikel indeholder de originale data.
Chagla, Z. & Madhukar, P. COVID-19-boostere i rige lande vil forsinke vacciner for alle.Chagla, Z. & Madhukar, P. COVID-19-boostere i rige lande vil forsinke vacciner for alle.Chagla, Z. og Madhukar, P. COVID-19-boostere i rige lande vil forsinke vacciner for alle.Chagla, Z. og Madhukar, P. COVID-19-revaccination i rige lande vil forsinke vaccination for alle.National medicin.27, 1659-1665 (2021).
Faust, L. et al.SARS-CoV-2-test i lav- og mellemindkomstlande: tilgængelighed og overkommelighed i den private sundhedssektor.mikrobiel infektion.22, 511-514 (2020).
Verdenssundhedsorganisationen.Global forekomst og forekomst af udvalgte helbredelige seksuelt overførte infektioner: en gennemgang og skøn.Genève: WHO, WHO/HIV_AIDS/2 https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/66818/WHO_HIV_AIDS_2001.02.pdf (2001).
Fenton, EM et al.Flere 2D støbte sideflow teststrimler.ASS ansøgning.Alma Mater.Inter Milan.1, 124-129 (2009).
Schilling, KM et al.Fuldt lukket mikrofluidisk papirbaseret analyseenhed.anus.Kemisk.84, 1579-1585 (2012).
Lapenter, N. et al.Konkurrencedygtig papirbaseret immunkromatografi kombineret med enzymmodificerede elektroder muliggør trådløs overvågning og elektrokemisk bestemmelse af urin-kotinin.Sensorer 21, 1659 (2021).
Zhu, X. et al.Kvantificering af sygdomsbiomarkører med en alsidig nanozym-integreret lateral væskeplatform ved hjælp af et glukometer.biologisk sensor.Bioelektronik.126, 690-696 (2019).
Boo, S. et al.Graviditetsteststrimmel til påvisning af patogene bakterier ved hjælp af concanavalin A-human choriongonadotropin-Cu3(PO4)2 hybrid nanoblomster, magnetisk adskillelse og smartphone-aflæsning.Mikrocomputer.Magasin.185, 464 (2018).